Procedimento da operação

1) Extração de ácido nucleico Extrair ADN de amostras utilizando um kit de extracção adequado.Recomenda-se que o ácido nucleico seja elutado com cerca de 100 μl de tampão de elução (TE ou H2O livre de nucleases) na etapa final da extracção.O ácido nucleico purificado deve ser utilizado imediatamente ou armazenado a - 20°C.

2) Preparação do controlo positivo O controlo positivo pode ser armazenado à temperatura ambiente antes da reidratação durante até 12 meses.Deve ser reidratado antes da utilização adicionando 250 μl de tampão TE ou H2O livre de nucleases, em vórtice a baixa velocidade durante 15 a 20 segundos e centrifugado a baixa velocidade durante 15 a 20 segundos.

3) Preparação da mistura RT-PCR em tempo real

A) Abrir a embalagem a vácuo e retirar as tiras de 8 tubos que contêm o reagente.Se os tubos fornecidos não forem compatíveis com o seu instrumento, transfira o reagente para um tubo óptico compatível com o seu instrumento.

B) Abrir os tubos e descartar a tampa (não adequado para máquinas de PCR em tempo real), e preparar a mistura de reação no gelo como abaixo

* Pode ser utilizada água sem nuclease como controlo negativo.

C) Selar os tubos com tampas ópticas ou placa de 96 poços com filme de vedação óptica (não fornecido).

D) Vortex os tubos a baixa velocidade durante 10 ~ 15sec, e centrifugar a 3000rpm durante 20sec e colocá-los em um instrumento de PCR em tempo real.

3) Configuração de RT-PCR: defina o volume de reação em 25μl e o procedimento de amplificação de PCR como se segue.Fluorescência de ROX (para Orf1ab) e CY5 (para o gene RNase P) a 60°C, e selecione NÃO como referência passiva.
4) Análise e interpretação dos resultados Definir a linha de limiar de acordo com as instruções do instrumento.

A) Controle de qualidade:

B) Interpretação dos resultados da amostra

Parâmetros técnicos: